Uffizi Galerisi aslında bir müze olarak değil, Floransalı sulh hakimleri için ofisler olarak inşa edilmiştir - İtalyanca'da "ofisler" anlamına gelen "Uffizi" adı da buradan gelmektedir. Toskana'nın ilk Grandükü Cosimo I de' Medici tarafından yaptırılan binanın temel amacı, Cosimo'nun yeni kurduğu grandüklük idaresini düzenleme ve güçlendirme çabalarının bir parçası olarak Toskana devletinin idari ofislerini tek bir çatı altında toplamaktı.
Bunun ötesinde Uffizi, o dönemde Avrupa'nın en zengin ve nüfuzlu ailelerinden biri olan Medici ailesinin sanat koleksiyonlarına ev sahipliği yapmak üzere tasarlanmıştı. Koleksiyonları büyüdükçe, Uffizi'nin bazı bölümleri yavaş yavaş bu eserleri seçkin bir izleyici kitlesine sergilemek için kullanıldı ve bir galeriye geçişin başlangıcını işaret etti. Medici hanedanının 18. yüzyılda sona ermesinin ardından, son Medici varisi Anna Maria Luisa de' Medici, tüm koleksiyonu şehirden asla ayrılmaması koşuluyla Floransa şehrine miras bıraktı. Bu koleksiyon, 1765 yılında resmi olarak müze olarak halka açılan ve bugün bildiğimiz Uffizi Galerisi'nin çekirdeğini oluşturmuştur.