Uffizi-galleriet byggdes ursprungligen inte som ett museum utan som kontor för de florentinska magistraterna - därav namnet "Uffizi", som betyder "kontor" på italienska. Byggnaden beställdes av Cosimo I de' Medici, den förste storhertigen av Toscana, och dess främsta syfte var att samla den toskanska statens administrativa kontor under ett tak, som ett led i Cosimos ansträngningar att organisera och stärka sin nyinrättade storhertigliga administration.
Utöver detta var Uffizierna också avsedda att hysa konstsamlingarna från familjen Medici, en av de rikaste och mest inflytelserika familjerna i Europa vid den tiden. I takt med att samlingen växte användes delar av Uffizi-galleriet för att visa dessa verk för en utvald publik, vilket markerade början på omvandlingen till ett galleri. Efter Medici-dynastins slut på 1700-talet testamenterade den sista Medici-arvingen, Anna Maria Luisa de' Medici, hela samlingen till staden Florens under förutsättning att den aldrig skulle lämna staden. Denna samling utgjorde kärnan i Uffizi-galleriet som vi känner det idag, officiellt öppnat för allmänheten som ett museum 1765.
