Galeria Uffizi została pierwotnie zbudowana nie jako muzeum, ale jako biura dla florenckich sędziów - stąd jej nazwa "Uffizi", co po włosku oznacza "biura". Zamówiony przez Cosimo I de' Medici, pierwszego wielkiego księcia Toskanii, budynek miał przede wszystkim skonsolidować biura administracyjne państwa toskańskiego pod jednym dachem, w ramach wysiłków Cosimo mających na celu zorganizowanie i wzmocnienie jego nowo utworzonej administracji wielkoksiążęcej.
Poza tym Uffizi miało również pomieścić kolekcje sztuki rodziny Medyceuszy, jednej z najbogatszych i najbardziej wpływowych rodzin w Europie w tamtym czasie. W miarę powiększania się kolekcji, część Galerii Uffizi była stopniowo wykorzystywana do prezentowania tych dzieł wybranej publiczności, co zapoczątkowało jej przekształcenie w galerię. Po wygaśnięciu dynastii Medyceuszy w XVIII wieku, ostatnia dziedziczka Medyceuszy, Anna Maria Luisa de' Medici, zapisała całą kolekcję miastu Florencja pod warunkiem, że nigdy nie opuści ona miasta. Kolekcja ta stanowiła rdzeń Galerii Uffizi, jaką znamy dzisiaj, oficjalnie otwartej dla publiczności jako muzeum w 1765 roku.
