Uffizi-galleriet ble opprinnelig ikke bygget som et museum, men som kontorer for de florentinske magistratene - derav navnet "Uffiziene", som betyr "kontorer" på italiensk. Bygningen ble bestilt av Cosimo I de' Medici, den første storhertugen av Toscana, og hovedformålet var å samle den toskanske statens administrative kontorer under ett tak, som et ledd i Cosimos forsøk på å organisere og styrke sin nyetablerte storhertugelige administrasjon.
Uffiziene var også ment å huse kunstsamlingene til Medici-familien, en av de rikeste og mest innflytelsesrike familiene i Europa på den tiden. Etter hvert som samlingen vokste, ble deler av Uffiziene gradvis brukt til å vise disse verkene for et utvalgt publikum, noe som markerte begynnelsen på overgangen til et galleri. Etter at Medici-dynastiet gikk under på 1700-tallet, testamenterte den siste Medici-arvingen, Anna Maria Luisa de' Medici, hele samlingen til byen Firenze på betingelse av at den aldri skulle forlate byen. Denne samlingen dannet kjernen i Uffizi-galleriet slik vi kjenner det i dag, og det ble offisielt åpnet for publikum som museum i 1765.
