Uffizi-galleriet blev oprindeligt ikke bygget som et museum, men som kontorer for de florentinske magistrater - deraf navnet "Uffizi", som betyder "kontorer" på italiensk. Bygningen blev bestilt af Cosimo I de' Medici, den første storhertug af Toscana, og dens primære formål var at samle den toscanske stats administrative kontorer under ét tag som led i Cosimos bestræbelser på at organisere og styrke sin nyetablerede storhertugelige administration.
Derudover var det også meningen, at Uffizierne skulle huse Medici-familiens kunstsamlinger, en af de rigeste og mest indflydelsesrige familier i Europa på det tidspunkt. Efterhånden som deres samling voksede, blev dele af Uffizi-galleriet gradvist brugt til at vise disse værker for et udvalgt publikum, hvilket markerede begyndelsen på dets overgang til et galleri. Da Medici-dynastiet sluttede i det 18. århundrede, testamenterede den sidste Medici-arving, Anna Maria Luisa de' Medici, hele samlingen til byen Firenze på den betingelse, at den aldrig ville forlade byen. Denne samling udgjorde kernen i Uffizi-galleriet, som vi kender det i dag, og som officielt blev åbnet for offentligheden som museum i 1765.
